成人T细胞白血病（ATL）是一种由人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）引起的致命性CD4⁺ T细胞恶性疾病，可分为侵袭性（包括急性型和淋巴瘤型）以及惰性（包括慢性型和潜伏型）两种类型。部分HTLV-1感染者会发展为侵袭性ATL，但目前对ATL的病毒或宿主分子决定因素了解甚少。HTLV-1编码的转录激活因子TAX蛋白通过调控多种信号通路参与HTLV-1感染细胞的永生化过程，但由于免疫反应的影响，大多数ATL患者的细胞中无法检测到TAX激活因子，因此需要进一步探索其他分子机制。

KIR3DL2是杀伤性免疫球蛋白样受体 （KIR）家族成员之一，主要由NK细胞和部分T细胞表达。KIR3DL2作为一种抑制性受体，通过与HLA-I类分子特异结合会抑制NK细胞和T细胞的活化及其细胞毒性。（图1.A）。研究发现其在皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）Sézary综合征中的异常高表达与预后相关，并且针对KIR3DL2的单克隆抗体Lacutamab在早期研究中显示了抗肿瘤活性。Lacutamab 作用机制是通过Fab端特异结合肿瘤细胞的KIR3DL2，其Fc端结合到免疫系统中特定细胞，例如NK 细胞，从而触发NK 细胞释放细胞毒性分子，诱导肿瘤细胞的裂解和死亡（图1.B）。近期研究发现某些ATL患者的肿瘤细胞中存在KIR3DL2的异常表达。Cheminant等人进一步探讨了KIR3DL2在ATL中的表达情况及其作为潜在治疗靶点的可能性，同时评估了抗KIR3DL2单克隆抗体Lacutamab在ATL治疗中的效果。

图1. (A) KIR3DL2结构及相互作用配体; (B) Lacutamab作用机制

研究方法

研究团队首先在一组ATL患者中通过流式细胞术（FC）评估了多种NKR（KIR2DL1/2DS1、KIR2DL2/2DL3/2DS2、KIR3DL2、NKG2A、NKG2C 和 NKp46）的表达，发现KIR3DL2在急性型ATL中高表达。随后，在ATL患者的组织样本中，通过免疫组化（IHC）观察KIR3DL2的表达情况，FC则用于定量检测患者外周血单核细胞（PBMC）中的KIR3DL2阳性细胞比例。利用Kaplan-Meier方法估计了不同KIR3DL2表达状态患者的生存率，并使用log-rank进行检验。通过HTLV-1感染实验和基因甲基化分析，探讨了KIR3DL2表达的机制。mRNA和蛋白表达通过利用qRT-PCR、靶向外显子组测序、PrimeFlow RNA检测和成像流式细胞术等技术检测。此外，使用lacutamab进行体外抗体依赖的细胞毒性（ADCC）实验，评估其对KIR3DL2⁺ ATL细胞的杀伤效果。

图2. 研究方法流程图

研究结果

1. KIR3DL2在急性ATL患者中高表达

研究通过检测ATL患者的PBMCs上NKR表达，发现KIR3DL2是唯一在急性型ATL肿瘤细胞上表达的受体（图3A）。通过评估110例ATL患者的KIR3DL2表达情况，发现90%的急性型ATL患者的T细胞异常表达KIR3DL2（图3C）。相比之下，淋巴瘤型或慢性/潜伏型ATL患者中KIR3DL2的阳性率显著降低（图3B-C）。此外，通过qRT-PCR发现KIR3DL2 mRNA在大多数急性型ATL患者中表达，而在慢性型和淋巴瘤型ATL患者中表达较少，且有两位最初被诊断为慢性型ATL的患者，随着疾病的急性化，他们的KIR3DL2 mRNA表达水平升高（图3D-E）。对于整个ATL患者队列，KIR3DL2阳性的患者2年生存率远低于KIR3DL2阴性的患者，表明KIR3DL2表达与较差的预后相关（图3F）。然而，在侵袭型ATL中，KIR3DL2表达对生存率没有显著影响（图3G）。

图3. KIR3DL2在急性型ATL患者中表达。(A) 热图显示KIR3DL2是唯一在ATL肿瘤细胞上表达的NKR基因；(B) 急性型ATL(P25)患者表达KIR3DL2，而淋巴瘤型ATL患者(P57)不表达；(C) 不同ATL亚型（急性型、淋巴瘤型和慢性型）中KIR3DL2⁺ 细胞的百分比；(D)一个慢性型ATL患者(P18)在转变为急性型ATL时变为KIR3DL2⁺；(E) KIR3DL2在急性型ATL患者中的mRNA表达水平较高；(F-G) KIR3DL2⁺（蓝色）与KIR3DL2−（红色）患者所有ATL亚型(F)和侵袭型ATL(G)的生存曲线。

2. HTLV-1感染可诱导KIR3DL2表达

研究评估了来自健康捐赠者的PBMCs在被激活或感染了HTLV-1后的KIR3DL2表达及作用。纯化的HTLV-1病毒粒子以剂量依赖性的方式诱导了CD4⁺ T细胞表达KIR3DL2（图4A）。使用植物血凝素/白细胞介素-2激活CD4⁺ T细胞并未诱导KIR3DL2的表达，这表明稳定的感染（而不仅仅是激活）对于KIR3DL2表达是必需的，且这种效应仅限于KIR3DL2。在CD4⁺ T细胞上，KIR3DL2蛋白和TAX mRNA的表达呈正相关（图5），且具有胞质共定位（图5B）。此外，TAX mRNA主要在KIR3DL2⁺CD4⁺ T细胞中表达，而KIR3DL2^- CD4⁺ T细胞的TAX mRNA呈阴性（图4B）。在提供信息的ATL患者中，有35%携带病毒启动子的5′-LTR区域的缺失，不能表达TAX，但仍表达了KIR3DL2。此外，2名ATL患者和1名HTLV-1携带者即使TAX mRNA未表达，也表达了KIR3DL2蛋白。综合这些结果表明，HTLV-1感染可诱导KIR3DL2表达，但并非通过TAX诱导。

图4. 体外HTLV-1感染诱导了CD4⁺ T细胞表达KIR3DL2。(A) 纯化的HTLV-1病毒粒子以剂量依赖性方式诱导CD4⁺ T细胞表达KIR3DL2；(B) 在KIR3DL2阳性的CD4⁺ T细胞中观察到TAX mRNA的表达，而在KIR3DL2阴性的CD4⁺ T细胞中未观察到。

图5. TAX mRNA与KIR3DL2蛋白在原发ATL肿瘤细胞中的表达正相关。(A) KIR3DL2⁺肿瘤细胞（红色）中TAX mRNA的表达高于KIR3DL2^- 细胞（蓝色）；(B) 肿瘤细胞的KIR3DL2和TAX mRNA具有胞质共定位；(C) TAX mRNA和KIR3DL2蛋白表达正相关。

3. KIR3DL2表达与启动子低甲基化正相关

考虑到DNA甲基化会影响NK细胞中KIR的表达多样性，研究评估了28位ATL患者、4位HTLV-1无症状携带者（ACs）和4位健康捐赠者的KIR3DL2启动子的DNA甲基化谱。其中，在急性型ATL患者中，KIR3DL2启动子的低甲基化与KIR3DL2的表达呈正相关（图6A）。DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞嘧啶（5-aza）处理能够降低KIR3DL2启动子的甲基化水平，并在Hut 78 T细胞系中诱导KIR3DL2的表达，而在Jurkat T细胞系中无效（图6B-C）。此外，5-aza单独治疗并不能在健康捐赠者或ATL患者中诱导KIR3DL2的表达，表明KIR3DL2的表达调控可能还涉及其他因素。

图6. KIR3DL2启动子在急性型ATL患者中呈现低甲基化状态。(A) 急性型ATL患者的KIR3DL2启动子的甲基化程度显著低于淋巴瘤型、慢性/潜伏型ATL或HTLV-1携带者；(B) 5-aza能够诱导Hut 78 T细胞系中KIR3DL2蛋白的表达，而对Jurkat细胞系无效；(C) 5-aza处理显著降低了Hut 78细胞中KIR3DL2启动子的甲基化水平。

4. Lacutamab对KIR3DL2⁺ATL细胞的杀伤效果

我们通过使用ATL患者的肿瘤细胞作为靶细胞（T）和自体NK细胞作为效应细胞（E）来评估 Lacutamab的抗肿瘤效果。在所有4个测试的KIR3DL2阳性患者样本中观察到随着效应/靶比（E/T）的增加，Lacutamab激活的NK细胞杀伤作用增强（P = .0006，图7A）。Lacutamab特异性地作用于KIR3DL2阳性细胞，对KIR3DL2阴性细胞无影响（图7B-D）。此外，Lacutamab抗体不会诱导ATL患者的效应NK细胞的死亡（图7C）。最后，我们通过在冷冻的KIR3DL2⁺原发ATL细胞上进行的ADCC实验（来自健康捐赠者的异源NK细胞），结果一致。这些结果表明， Lacutamab靶向KIR3DL2⁺ 原发性ATL肿瘤细胞，激活自体NK细胞驱动ADCC，诱导ATL肿瘤细胞裂解死亡。

图7. Lacutamab在自体ADCC实验中特异性地杀伤KIR3DL2⁺ 原发ATL细胞。在加入指定效应/靶比(E/T)的自体NK细胞后， KIR3DL2⁺(A)和KIR3DL2^-(B)CD4⁺肿瘤细胞以及KIR3DL2⁺ ATL患者(C)的NK细胞的死亡情况。作为对照，也评估了KIR3DL2^- ATL患者中KIR3DL2^- 肿瘤细胞的死亡(D)。

结论

KIR3DL2在急性型ATL中高表达，并与患者的不良预后相关，可作为一个潜在靶点。由于KIR3DL2可以在常规固定的组织切片上使用 FC 轻松且特异性地检测到，因此KIR3DL2作为一种可靠的标志物，有助于诊断急性型 ATL。KIR3DL2高表达可能由HTLV-1感染引发，并与KIR3DL2基因启动子区域的去甲基化有关。单克隆抗体Lacutamab在体外实验中针对表达KIR3DL2的ATL细胞显示出良好的抗肿瘤活性，未来有望成为ATL治疗的新策略。

参考文献

Cheminant M, Lhermitte L, Bruneau J, et al. KIR3DL2 contributes to the typing of acute adult T-cell leukemia and is a potential therapeutic target. 2022;140(13):1522-1532.

Shaw J, Kollnberger S. New perspectives on the ligands and function of the killer cell immunoglobulin-like receptor KIR3DL2 in health and disease. Front Immunol.2012;3:339. Published 2012 Nov 16.

Marie-Cardine A, Viaud N, Thonnart N, et al. IPH4102, a humanized KIR3DL2 antibody with potent activity against cutaneous T-cell lymphoma. Cancer Res. 2014;74(21):6060-6070.

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