T细胞受体（T cell receptor，TCR）是T细胞表面表达的异二聚体分子，负责识别并结合抗原肽-MHC复合物，激活T细胞介导的免疫应答。TCR分为两种类型：由α和β链组成的TCRαβ，以及由γ和δ链组成的TCRγδ。在人体外周血中，TCRαβ占90%至95%，是适应性免疫反应的主要执行者。TCR的每条肽链又可分为可变区（V区）、恒定区（C区）、跨膜区和胞质区等几部分。TCR通过V区互补决定区来识别抗原，β链由V、D、J三个基因编码、α链由V、J两个基因编码。而α和β两条肽链的V区（Vα、Vβ）又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。TCR Vβ的CDR3由V、D、J三个基因编码，在淋巴细胞的成熟过程中，通过V、D、J基因的重排形成了各种重组序列片段，再加上体细胞超突变（Somatic Hypermutation, SHM）形成了T细胞的多样性。在肿瘤免疫治疗领域，TCR的多样性和特征分析已成为揭示肿瘤与免疫系统相互作用的关键。

TCR组库测序及分析流程

1. TCR组库测序：通常涉及从样本中提取T细胞的DNA或RNA，然后利用多重PCR或5'RACE技术针对β链的CDR3区进行特异性扩增，构建测序文库。在这个过程中，可以应用MIGEC软件基于SMART技术的UMI校正，确保每个独特的TCR序列都能被准确计数，减少由于PCR扩增导致的重复序列。此外，结合流式细胞分选技术，可以根据T细胞的表型特征选择特定的T细胞亚群进行单细胞测序，实现单细胞水平上的免疫受体库重构。

2. 测序数据预处理：首先将原始测序reads与V、D和J基因序列的参考集比对，然后将相同的序列组合成单个克隆型。随后剔除质量较差的reads，修正PCR和测序错误，得到定量克隆型信息。有大量的工具可以用于处理bulk实验中的TCR测序reads，其中MiXCR仍然是最受欢迎的选择。

3. TCR组库分析：这一步骤主要针对TCRβ链在基因水平和氨基酸水平上的多样性进行分析。为此，开发了多种生物信息学工具，如VDJtools、LymphoSeq、tcR (R包)等，计算用于快速解析T细胞的克隆扩增情况，并采用Shannon指数、Simpson指数及Gini系数等量化多样性指标，不同样本间TCR组库的相似性利用重叠性指标，如Morisita-Horn指数和Jaccard指数衡量。

4.临床相关指标分析：使用Kaplan-Meier对数秩分析和Cox比例风险模型对不同TCR特征分组进行生存分析进行预后评估。利用GSVA（R包）通过评估不同免疫细胞亚群的活性，以及它们与TCRβ多样性的相关性进行免疫表型评分等。

TCR组库分析在肿瘤免疫中的应用

1. 肿瘤免疫微环境分析：Chen等人对参与ADJUVANT-CTONG 1104试验的II/III期非小细胞肺癌（NSCLC）患者进行了TCR组库分析，首次探究了EGFR驱动NSCLC阳性患者辅助靶向治疗疗效与免疫微环境的相关性。研究发现，具有较高TCR多样性的患者展现出更好的总体生存率（OS）。Vβ5-6Jβ2-1、Vβ20-1Jβ2-1、Vβ24-1Jβ2-1和Vβ29-1Jβ2-7这4种TCR Vβ-Jβ重排的高频率与患者OS的显著延长相关。这些TCR的加权组合不仅与患者的OS和无病生存期（DFS）紧密相关，还能有效区分TCR多样性的不同水平。其中，Vβ5-6Jβ2-1、Vβ20-1Jβ2-1和Vβ24-1Jβ2-1与吉非替尼治疗反应正相关，而Vβ29-1Jβ2-7则与化疗效果相关。这些结果表明，特定的TCR Vβ-Jβ重排可能作为预后和预测辅助性吉非替尼治疗及化疗效果的生物标志物，为EGFR突变的II/III期NSCLC患者的个性化治疗提供了新方向（JCI Insight. 2022;7:e152631）。

图1.  非小细胞肺癌(NSCLC)患者的TCR组库分析流程。来自ADJUVANT-CTONG 1104试验的II/III期NSCLC患者，携带表皮生长因子受体(EGFR)突变，被分为两组接受治疗：一组接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(TKI-Gefitinib)，另一组接受长春瑞滨/顺铂(Chemo-VP)化疗。收集并分离了TKI-Gefitinib组和Chemo-VP组患者石蜡保存的预处理肿瘤组织及其邻近组织，用于DNA分析和多重PCR，以进行TCRβ测序，探索TCR库与临床结果之间的相关性。

2. 预后评估：Guo等人通过高通量TCR测序和单细胞RNA测序技术，探究了肾细胞癌（RCC）发展不同阶段和治疗前后外周T细胞TCRβ多样性的变化，并分析了TCRβ多样性和RCC的动态关系。研究发现，较高的TCRβ多样性与较多的淋巴细胞，尤其是更多的初始T细胞相关联。在IV期患者中，高水平的基线TCRβ多样性预示着更佳的预后。此外，研究还观察到，与低肿瘤负荷的良性和I期RCC患者相比，高肿瘤负荷的IV期患者在术前的TCRβ多样性显著降低。然而，在晚期患者中，当大部分肿瘤负担通过细胞减少性肾切除术（CN）得到缓解后，TCRβ多样性得以恢复，T细胞耗竭现象减少，且观察到初始T细胞的动员。这表明TCR库能够反映免疫状态并预测预后，为免疫治疗提供了新的视角（J Pathol. 2020;251:26-37.）。

图2.  肾细胞癌(RCC)患者治疗前后原始T细胞高克隆多样性变化。（A）一位IV期未经治疗的RCC患者术前和术后的外周血单核细胞(PBMC)样本的单细胞RNA测序(scRNA)数据可视化；（B）堆积条形图展示了所有外周血和T细胞群体中不同亚型细胞的比例；（C）术前和术后的不同T细胞亚型中TCRB克隆型的分布。

3. 指导免疫治疗：Valpione等人的研究表明，在转移性黑色素瘤患者中，接受抗PD-1药物治疗前，肿瘤浸润T细胞（TIL）的高TCR克隆与总体生存率（OS）显著相关。这一发现指出，治疗前TIL的TCR克隆是预测患者对PD-1阻断疗法反应的重要生物标志物。此外，研究还发现，在多种癌症中，治疗前TIL的TCR多样性与较好的OS相关联。综上，TCR组库分析有助于识别可能从免疫检查点抑制剂治疗中获益的患者群体，这些发现为个性化免疫治疗策略的制定提供了新的视角（Nat Commun. 2021;12:4098.）。

图3. 多癌种治疗前肿瘤浸润性T细胞的TCR多样性与改善的总生存期相关性。（A）癌症队列中肿瘤浸润 T 细胞 （TIL/Tc） 的估计总数，TIL/Tc平均计数在前25%的队列以蓝色突出显示；（B-G）在几种癌症样本中高（蓝色）TIL 多样性患者具有良好的预后。

4. 监测治疗反应：Han等人对非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤浸润T细胞（TILs）和外周血中的PD-1+CD8+T细胞进行了TCR深度测序分析。研究揭示了肿瘤/血液中共享TCR克隆的频率可作为反映肿瘤对免疫治疗反应潜能的指标，可能预测患者在接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗中的疗效和生存益处。基于此，研究团队开发了一个新的免疫应答指数（TIR index），用以评估肿瘤微环境中特异性T细胞的水平。研究发现，在TIR index高的患者中，炎性因子的释放水平、抗原呈递功能以及免疫杀伤潜力均表现出优势。此外，对患者治疗过程中的外周血PD-1+CD8+TCR进行了动态监测，观察到共享克隆频率的变化可能反映了外周血中肿瘤特异性T细胞的活化、扩增和转运过程，从而证实了TIR index在监测免疫治疗反应中的应用价值，并为免疫应答机制提供了新的视角（Sci Adv. 2021;7:eabd6971）。

图4. 抗PD-1/PD-L1治疗中TIR指数与临床结果的相关性研究。(A) 研究设计概览；(B) TIR指数定义：通过肿瘤组织与分离的外周PD-1+CD8+T细胞的TCR库重叠程度计算TIR指数；(C) 抗PD-(L)1治疗的无应答者（红点，n=25）与应答者（灰点，n=6）的TIR指数分布比较；(D) 确定TIR指数的截断值，使用ROC曲线区分应答者和无应答者；(E) TIR指数与无进展生存期（PFS）的关联；(F) TIR指数与总生存期（OS）的关联。

结论

TCR组库分析作为一种强有力的工具，不仅能够揭示肿瘤免疫微环境的复杂性，还能为肿瘤患者的个体化治疗提供重要信息。随着技术的不断进步和研究的深入，TCR分析有望在肿瘤免疫治疗领域发挥更大的作用。

参考文献

1.Chen C, Liu SM, Chen Y, et al. Predictive value of TCR Vβ-Jβ profile for adjuvant gefitinib in EGFR mutant NSCLC from ADJUVANT-CTONG 1104 trial. JCI Insight. 2022;7(1):e152631. Published 2022 Jan 11. doi:10.1172/jci.insight.152631

2.Guo L, Bi X, Li Y, et al. Characteristics, dynamic changes, and prognostic significance of TCR repertoire profiling in patients with renal cell carcinoma. J Pathol. 2020;251(1):26-37. doi:10.1002/path.5396

3.Valpione S, Mundra PA, Galvani E, et al. The T cell receptor repertoire of tumor infiltrating T cells is predictive and prognostic for cancer survival [published correction appears in Nat Commun. 2021 Jul 22;12(1):4588. doi: 10.1038/s41467-021-24897-w]. Nat Commun. 2021;12(1):4098. Published 2021 Jul 2. doi:10.1038/s41467-021-24343-x

4.Han J, Yu R, Duan J, et al. Weighting tumor-specific TCR repertoires as a classifier to stratify the immunotherapy delivery in non-small cell lung cancers. Sci Adv. 2021;7(21):eabd6971. Published 2021 May 19. doi:10.1126/sciadv.abd6971

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